不溶性微粒检测仪—MFI（微流成像颗粒分析系统）技术原理及应用分享

不溶性微粒检测必要性

不溶性微粒（英文：Sub-visible Particle/particulate matter），指不溶于水和有机溶剂，非代谢性的，肉眼所看不见的颗粒物。粒径范围一般在2-50μm之间，主要来源于药品生产、储存、运输过程及临床配药操作污染等途径以及药物配伍使用时发生物理或化学性质的变化。由于不溶性微粒不能在体内代谢，极少量的不溶性颗粒都会激活非特异的免疫应答，增加潜在的免疫原性，进入血管会引起阻塞，产生肉芽肿、静脉炎、血栓以及组织坏死。因此各国药典对不溶性微粒分别制定了严格的判定标准，中国药典2020版0903章节不溶性微粒检测法与国际检测标准保持一致，第一法为光阻法，第二法为显微计数法。

中国药典2020版规定对于黏度过高和易析出结晶的制剂，以及进入传感器时容易产生气泡的注射剂，光阻法不适用，应以显微计数法的测定结果作为判定依据。而且光阻法只能对颗粒的大小和浓度进行检测，对于透光性高的颗粒以及颗粒的形状无法表征，对样品中颗粒信息了解非常有限；而显微计数法需要经过抽滤、烘干处理，使得颗粒形态与在制剂配方中存在一定的差异。由于药典检测方法的局限性，美国药典 <1787>将微流成像分析技术推荐作为不溶性微粒大小和形态的表征。

不溶性微粒检测工具

微流成像颗粒分析系统 MFI 由数字显微技术、微流体和图像处理技术整合成一个全自动分析颗粒或细胞的仪器。当样品流过检测区时，高频成像检测器会动态连续检测样品中的颗粒，每个颗粒将被分析，生成关于颗粒的数量、尺寸、透明度、形态等方面的数据。通过软件对颗粒数据照片进行相应的归类和计数分析。

微流成像颗粒分析系统 MFI 广泛应用于对生物大分子制剂开发、稳定性评价、包材筛选等生产过程中；同时在细胞和基因治疗中助力生产工艺进行质控、病毒载体工艺开发、病毒载体稳定性研究等方面；此外对各类疫苗的开发和稳定性评价也发挥其作用。

MFI应用案例

1、RNA药物制剂开发

2020年德国CureVac公司Fabian Johannes EBER , Benyamin YAZDAN PANAH等人利用MFI检测长链RNA在采用不同工艺参数制备冻干，复溶后亚可见颗粒的情况。并为该工艺申请专利。（专利号：US20200383919A1）。因为RNA稳定性极差，极易被广泛存在的核糖核酸酶或二价阳离子降解。所以通常RNA溶液会贮存在-20℃，甚至是-80℃条件下。如此条件成本太高，在运输和贮存过程中，也无法时刻保持温度恒定。因此，广泛采用冷冻干燥法贮存RNA，以提高其稳定性、耐热性和保质期。MFI（Micro-Flow Imaging）微流成像颗粒分析方法对冻干以及复溶后的亚可见颗粒检测具有更高准确性和鉴别能力，适合RNA药物治疗产品中微粒分析，用于工艺优化和制剂评价，提高产品质量和稳定性。

2、基因治疗—AAV生产超滤工艺中颗粒监测

AAV作为基因治疗载体，其生产过程中超滤环节是将AAV浓缩并置于最终制剂配方缓冲液。作为生产工艺中关键步骤，需对该工艺过程进行颗粒监控。美国Voyager Therapeutics公司利用MFI研究AAV2和AAV9两个血清型病毒载体，助力其在浓缩超滤工艺开发过程中产生的亚可见颗粒的检测。结果显示1-10 μm之间颗粒存在明显差异。两个批次A和B实验对于特定的膜批次，当处理时间较长时，亚可见颗粒浓度较高。与较低TMP（跨膜压差）6.5 psig相比，当采用更高TMP（20 psig）进行超滤时，亚可见颗粒浓度降低。MFI具备自动进样系统，一次可自动检测多达90个样品，非常适合AAV生产过程中工艺优化。

3、重组蛋白疫苗—铝佐剂制剂开发

图2. 用MFI检测(n=3) 0.25mg/ml磷酸铝配方在5 mM琥珀酸中颗粒数，研究不同pH值对粒径大小(1-2 μm，≥2 μm)颗粒的影响。1-2 μm颗粒数/mL(深灰色), ≥2 μm颗粒数/mL(浅灰色)，1-2至2μm颗粒数/mL(黑圈)。数据报告为平均颗粒计数或比值±SD (n=3)

铝盐被广泛用作佐剂，以增强T细胞对纯白蛋白和亚单位疫苗的反应，来自辉瑞公司药物研发部科学家利用MFI评估制剂配方条件对含铝佐剂疫苗可再悬浮性的影响。离子强度、PH和抗原浓度会显著影响颗粒大小和再分散。结果显示，无抗原的磷酸铝佐剂内的颗粒粒径和PH值相关。与pH=4和6相比，当pH=5时，≥2 μm颗粒浓度有明显增加，因磷酸铝颗粒的相互作用增强，进而导致≥2 μm颗粒数增加。

参考文献

[1] Langford A , Horwitz T , Adu-Gyamfi E , et al. Impact of Formulation and Suspension Properties on Redispersion of Alμminμm-Adjuvanted Vaccines[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2020, 109( 4):1460-1466.

[2] Arunkμmar A , Singh N . Ultrafiltration behavior of recombinant adeno associated viral vectors used in gene therapy[J]. Journal of Membrane Science, 2020.

[3] Ahmadi M , Bryson C J , Cloake E A , et al. Small Amounts of Sub-Visible Aggregates Enhance the Immunogenic Potential of Monoclonal Antibody Therapeutics[J]. Pharmaceutical Research, 2015, 32(4):1383-94.

[4] Fabian Johannes EBER , Benyamin YAZDAN PANAH , Stefanie SEWING , et al. Dry powder composition comprising long-chain RNA [P]. US20200383919A1, 2020-12-10.